Técnica histológica y posibles artefactos

Introducción

Las etapas del proceso de preparación de una muestra biológica para estudiarla microscópicamente se resumen brevemente en esta lectura a pesar de las complejidades de cada procedimiento.

Etapas de la Técnica Histológica

Fijación:

La fijación está destinada a conservar la estructura de células y tejidos. El fijador más utilizado es el formaldehído.

¿Porqué es importante fijar las muestras biológicas?

  • Para conservar la estructura celular o tisular.
  • Para evitar o detener la autodestrucción celular (autólisis)
  • Para aumentar la consistencia del tejido.
  • Para conservar la estructura celular se utilizan medios físicos (congelación, calor) o químicos.
  • Para destruir microorganismos patógenos.
  • Para evitar alteraciones en el preparado y retracción del tejido.

Luego de completada la etapa de fijación con formaldehído en solución acuosa debe extraerse el agua de la muestra fijada mediante un paso que se denomina deshidratación. La muestra se deshidrata mediante sucesivos baños en alcoholes de concentración creciente hasta alcanzar alcohol 100°. Posteriormente el alcohol debe ser extraído mediante un reactivo que sea miscible en parafina y en alcohol por ejemplo con xilol (agente aclarante), este paso se denomina aclaramiento o desalcoholización.

Inclusión:

La inclusión consiste en embeber la pieza histológica en parafina líquida, se encastra en un molde, y se deja enfriar hasta que adquiera un estado sólido para posteriormente cortarlo.

¿Porqué deben embeberse las piezas histológicas en un medio de inclusión?

  • Para poder obtener cortes muy finos, las muestras son embebidas en un medio de soporte (medio de inclusión) que les otorgue consistencia permitiendo una adecuada manipulación del material.
  • Se utilizan ceras o resinas como medio de inclusión, que en estado líquido rodean y penetran la muestra y posteriormente al enfriarse se transforman en un bloque rígido.

¡A cortar!

La microtomía es la obtención de cortes lo muy delgados que permitan su posterior visualización con el microscopio.

Fotografía A: Micrótomo con bloque de parafina.

Para la microscopía óptica el instrumento que nos permite realizar cortes tan delgados de 5 a 15 micrómetros, se llama micrótomo y posee una cuchilla de acero. (Ver fotografía A)

Para la microscopía electrónica de transmisión se necesitan realizar cortes ultrafinos de 40-70 nanómetros, y el instrumento que permite lograrlo es el ultramicrótomo. El ultramicrótomo posee una cuchilla de vidrio o de diamante. (Ver fotografía B y C)

Fotografías B: Desde el ocular del ultramicrótomo
Fotografía C: Ultramicrótomo

A medida que se obtienen los cortes en parafina, se colocan en el baño de flotación y se adhieren a un portaobjetos. El baño de flotación contiene agua, una poca cantidad de polvo de gelatina, una temperatura de 41-42°C favoreciendo la adhesión del corte al portaobjetos. (Ver fotografía D).

Fotografía D: Baño de flotación

¡A teñir!

Dado que los cortes en parafina carecen de color, se necesita teñir la muestra. Para realizar la tinción en primer lugar debe extraerse la parafina, puesto que es hidrófoba y la mayoría de los colorantes se emplean en solución acuosa. Por lo que si la parafina no es extraída, el tejido no se teñirá.

La parafina se extrae con xilol, un solvente que se denomina agente aclarante. El xilol debe extraerse por alcohol absoluto, y posteriormente se llevan los cortes mediante soluciones de alcohol decrecientes hasta un medio acuoso para realizar la tinción. Luego de realizada la tinción, se vuelve a deshidratar el tejido, se coloca xilol y se coloca el cubre objeto.

¿Qué es un artefacto histológico?

Un artefacto histológico es un error producido durante el proceso de preparación del tejido haciéndose evidente una vez que observamos el preparado con el microscopio. Pueden producirse en cualquier etapa de la preparación y se relacionan con:

  • El estado de los instrumentos.
  • La cuchilla del micrótomo desafilada o floja.
  • El estado de las sustancias utilizadas.
  • Los intervalos de tiempo que se empleen durante la fijación, deshidratación o coloración no sean los adecuados.
  • Descuidos en el montaje y en la colocación del cubreobjetos.
Artefactos histológicos: El tejido se encuentra doblado sobre sí mismo. Las estructuras celulares y tisulares no se conservaron ya que la muestra fue fijada con una sustancia inadecuada.

La importancia de fijar las muestras histológicas: Se presentan tres microfotografías fijadas en diferentes sustancias

La microfotografía 1 corresponde a un corte de testículo teñido con hematoxilina y eosina (H-E), el órgano fue fijado con agua, por lo que presenta putrefacción, no se conservó ninguna estructura celular, solo se distingue la forma de unos pocos túbulos seminíferos.

La microfotografía 2 corresponde a un corte de riñón teñido con hematoxilina y eosina (H-E), se realizó la fijación con formol al 10%; si bien es posible reconocer que el preparado corresponde a riñón, no presenta buena calidad, esto podría deberse a que durante la tinción con hematoxilina y eosina, la eosina no fue colocada rápidamente, y por ende tiñó demasiado el tejido, dificultando la visualización de calidad de las estructuras.

La microfotografía 3 corresponde a un corte de corazón, fue fijada con formol 10% y coloreada con Tricrómico Cajal Gallego (TCG), se observa una imagen de mayor calidad que las mencionadas anteriormente. Es posible reconocer las fibras musculares con sus respectivos núcleos e incluso sus estriaciones transversales.

Todas las imágenes de esta lectura fueron tomadas durante el curso “Profundización en Histología y Embriología” Facultad de Medicina, UdelaR en el año 2017.

Se encuentra disponible una breve autoevaluación sobre la técnica histológica.

Bibliografía:

  • GARCIA DEL MORAL, Raimundo. “Laboratorio de Anatomía Patológica” Interamericana-McGraw Hill, 1993
  • Geneser, F., Histología. Editorial Médica Panamericana. 3° edición
  • Protocolo de clases prácticas de Histología (2017) Ciclo básico clínico comunitario. Facultad de Medicina, Udelar
  •  Ross, M., (2007), Histología: Texto y atlas color con Biología Molecular Y Celular. Editorial Médica Panamericana
  • Rosa, L (2017) Destrezas​ ​prácticas​ ​de​ ​laboratorio​ ​y​ ​comparación de​ ​técnicas​ ​histológicas.
  • S.PODESTA, I.SANSON, “Introducción a las Técnicas Histopatológicas” Facultad de Medicina

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